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在本期内容中，我们介绍了一些关于统计的背景知识，来帮助你理解定量结果的意义。

本月的特色文章讲述了利用少量细胞进行单个氨基酸点突变的深度分析。如果您最近也有文章发表并且希望我们列举在下一期的Newsletter中，请发给我们 相关的PDF 或者URL。

本月Mascot小贴士关于对谱峰列表进行去电荷，所产生正、反两方面的影响。

如果您有任何意见或问题，请随时联系我们。

定量结果的可靠性——如何理解统计

Mascot Server和Distiller支持的多数定量方法都是基于肽段水平的。多肽再随之组装到蛋白家族中，多肽的定量结果也被用于计算蛋白量的比值。Mascot使用了一些统计检验方法来说明结果的质量和可靠性。

为了最大限度地利用您的数据，了解这些检验方法能提供什么信息，这对你是非常有用的。下面是应用的统计方法的概览。

• Significance test用于确定蛋白质的比值是否有显著变化。其中一个例子是Student's t-检验被用来比较一个样本总体的平均值与一个空假设中指定的假设值。
• 肽段的标准偏差决定了蛋白质比率的差异倍数是否显著。变异程度越高，其结果显著的可能性就越小。变异可能是由于检测产生的伪影、不正确的肽段分配或不同比值蛋白质的共享肽段所导致的。
• 由于T检验假设测试总体的对数值符合正态分布，这个假设是由Shapiro-Wilk W--检验来评估的。没有通过检验的蛋白质比值用斜体显示，表明你应该更谨慎地评估它们。
• 一些异常值的剔除法(如Dixon's，Grubbs'和Rosner's)是用于清理不合理值的数据。分别进行异常值剔除和含有异常值的分析是明智的选择，这样可以看看结果是否不同。
• 为了减少系统误差，您可以选择归一化来计算出的蛋白质比值。这使得所有多肽的平均或中位比值(取决于所选择的蛋白质比值计算方法)趋近于1。

点击这里了解关于如何对你的定量结果进行最充分的解读。

使用Mascot发表的优秀文章

在这里，我们列举了一篇近期发表的有趣并且很重要的文章，该文章运用Mascot 进行了蛋白质鉴定、定量及特性分析，如果您想要您的文章也在这里重点推荐，请发给我们一个PDF或URL。.

Single Amino Acid Variant Discovery in Small Numbers of Cells

Zhijing Tan, Xinpei Yi, Nicholas J. Carruthers, Paul M. Stemmer, and David M. Lubman

J. Proteome Res., Article ASAP, published online November 7, 2018

作者对九个Panc-1细胞水平的蛋白质组进行了深度的蛋白谱分析，以寻找与癌症相关的单氨基酸变异体(SAAV)。他们采用样品分馏、TMT 标记、载体/参考蛋白组和LC/MS/MS分析相结合的方法。

在9个细胞中，检测到了47414个多肽和6291个蛋白质，占5000个细胞检测结果的84%。他们将产生这样的覆盖范围归因于三个方面：利用载体/参考可以触发对所选离子的数据采集，将样品分为9个馏分，以及尽量减少样品处理步骤以减少损失。

确定SAAV的一个关键方面是需要过滤掉许多假阳性。对数据进行数据库搜索后，利用SavControl软件实现突变肽段的鉴定，首先利用Transfer FDR控制的方法过滤掉错误的多肽鉴定，然后通过不受限制的质量偏移的重新定位和引入修饰等替代解释来评估SAAV位点的可靠性。

该方法在9个细胞的Panc-1样品中，共发现了79个SAAV，在5000个细胞规模的样品中鉴定到了174个SAAV。另外， 这其中包括8种以前报道的与癌症有关的SAV，它们来自8种蛋白质。

Mascot 小贴士

如果您的原始文件包含profile数据，并且使用Mascot Distiller进行谱峰提取，则您的谱峰列表将是去同位素的。由于Distiller提取谱峰的工作方式，所以这是自动进行的，在搜库中总能提高匹配的得分。MS/MS谱峰列表是否要去电荷也可供用户选择。去电荷可能有好处，也可能有坏处，这取决于原始数据的特性和质量。

Mascot Server将实验得到的MS/MS二级离子质量与单/双电荷离子的计算值相匹配. 如果有大量的母离子的价态为4⁺或更多，则二级谱很可能包含价态大于2⁺的碎片，如果谱峰列表仅包含m/z值，则这些碎片不能匹配。 这种价态在ETD碎裂模式和和进行top-down分析时是常见的。在这种情况下，为了得到一个合适的匹配，碎片离子去电荷后转为MH⁺保存是十分重要的。您将在Distiller的首选项中找到控制谱峰列表格式的选项，如右图所示，在MS/MS峰值列表中的碎片离子下面。选择MH⁺输出作为启用去电荷。

如果你数据中的母离子多数是2⁺和3⁺，那么大部分碎片可以匹配为m/z值，而且去电荷的好处也不大。如果数据信号比较弱或者是噪音，Distiller调用的离子价态不正确，那么可能匹配的m/z值就不再匹配了。例如，一个2⁺离子它的同位素峰可能缺失被标为1⁺。或者，噪声峰出现在恰好是使1⁺的分布看起来像2⁺的地方。这些情况在高信号强度中是罕见的，但随着检测极限的接近而变得更加普遍。

如果你处理的数据不是来自ETD碎裂或者top-down方法，那么去电荷并不是一个必须的操作，确定这是否是一个好主意的最安全的方法是两种方法都尝试一下，对两个谱峰列表进行搜库，并在相同的FDR中比较灵敏度。任何给出较高灵敏度的都是更好的选择。

关于 Matrix Science

Matrix Science 为蛋白组学的研究人员以及科学家提供生物信息分析工具，帮助他们更快速，更可信的鉴定和定量蛋白。Mascot 软件全线支持来自Sciex, Agilent, Bruker, Shimadzu, Thermo Scientific 以及 Waters质谱仪生成的质谱数据。

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